معاونت پژوهش و فناوري
فرم منشور اخلاق پژوهش
اينجانب مريم حاجي حسيني دانشجوي رشته زيست‏شناسي گرايش ميکروبيولوژي تعهد مي نمايم که اصول زير را در انجام پايان نامه مدنظر قرار داده ام.
1- اصل برائت: التزام به برائت جويي از هرگونه رفتار غيرحرفه اي و اعلام موضع نسبت به کساني که حوزه علم و پژوهش را به شائبه هاي غيرعلمي مي آلايند.
2- اصل رعايت انصاف و امانت: تعهد به اجتناب از هرگونه جانب داري غيرعلمي و حفاظت از اموال، تجهيزات و منابع دراختيار.
3- اصل ترويج: تعهد به رواج دانش و اشاعه نتايج تحقيقات و انتقال آن به همکاران علمي و دانشجويان به غير از مواردي که منع قانوني دارد.
4- اصل احترام: تعهد به رعايت حريم ها و حرمت ها در انجام تحقيقات و رعايت جانب نقد و خودداري از هرگونه حرمت شکني.
5- اصل رعايت حقوق: التزام به رعايت کامل حقوق پژوهشگران و پژوهيدگان (انسان،حيوان، نبات) و ساير صاحبان حق.
6-اصل راز داري: تعهد به صيانت از اسرار واطلاعات محرمانه افراد، سازمان ها و کشور و کليه افراد و نهادهاي مرتبط با تحقيق.
7- اصل حقيقت جويي: تلاش در راستاي پي جويي حقيقت و وفاداري به آن و دوري از هرگونه پنهان سازي حقيقت.
8- اصل مالکيت مادي و معنوي: تعهد به رعايت کامل حقوق مادي و معنوي دانشگاه و کليه همکاران پژوهش.
9- اصل منافع ملي: تعهد به رعايت مصالح ملي و در نظرداشتن پيشبرد و توسعه کشور در کليه مراحل پژوهش.
محل امضاء و تاريخ
دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
دانشکده علوم پايه
پايان نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد در رشته زيست‏شناسي
گرايش ميکروبيولوژي
عنوان
بررسي مقاومت دارويي و فراواني ژنهاي blaVIM و blaNDM در اسينتوباکتربوماني هاي ايزوله شده از بيماران شهرتهران
استاد راهنما
دکتر رضا ميرنژاد
نگارنده
مريم حاجي حسيني
دي‏ماه 93
يَرفَعُ اللهَ الذيِنَ آمَنوُا مِنکُم وَ الذيِنَ اوُتوالعِلم دَرَجَات
” قرآن کريم ”
تصـويب نامــه
پايان نامه کارشناسي ارشد خانم مريم حاجي حسيني
با عنوان بررسي مقاومت دارويي و فراواني ژنهاي blaVIM و blaNDM در اسينتوباکتربوماني هاي ايزوله شده از بيماران شهرتهران
در جلسه مـورخ ………………………………… تحت نظارت شـوراي پايان نامـه متشکل از اسـتادان زير با درجه …………………………….. و نمره ……………………….. مورد تأييد قرار گرفت .
1- استاد راهنما : دکتر رضا ميرنژاد امضاء
2- استاد داورداخل گروه: …………………………………………………… امضاء
3- استاد داورخارج گروه:……………………………………………………. امضاء
دکتر شهرام رضوان بيدختي
معاون پژوهش و فناوري دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
تاريخ ………………… امضاء ………………..
سپاس بي کران پروردگار يکتا را که هستي مان بخشيد و به طريق علم و دانش راهنمايمان شد و به هم نشيني رهروان علم و دانش مفتخرمان نمود و خوشه چيني از علم و معرفت را روزيمان ساخت.
با تقدير و تشکر شايسته از استاد فرهيخته آقاي دکتر رضا ميرنژاد که با نکته هاي دلاويز و گفته هاي بلند ، صحيفه هاي سخن را علم پرور نمود و همواره راهنما و راه گشاي نگارنده در اتمام واکمال پايان نامه بوده است
وبا تقدير و درود فراوان خدمت پدر و مادر بسيار عزيز ، دلسوز و فداکارم که پيوسته
جرعه نوش جام تعيلم و تربيت ، فضيلت و انسانيت آنها بوده ام و همواره چراغ وجودشان
روشنگر راه من در سختي ها و مشکلات بوده است
و در اخر تشکر مي کنم از همسرم، که در سايه همياري و همدلي او به اين منظور دست يافتم.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکيده1
فصل اول – مقدمه
1-1- بيان مسأله2
1-2- ضرورت انجام تحقيق3
1-3-اهداف پژوهش4
1-4-فرضيه‏ها4
1-5-تعريف متغيرها4
فصل دوم – مروري بر تحقيقات انجام شده
2-1- تاريخچه جنس اسينتوباکتر بوماني6
2-2- تاکسونومي رايج اسينتوباکتر بوماني7
2-3- شناسايي گونه هاي اسينتوباکتر7
2-4- جايگاه طبيعي اسينتوباکتر بوماني8
2-5.فاکتورهاي بيماري زايي اسينتوباکتر8
2-6.منشا کلينيکي عفونت هاي اسينتوباکتر بوماني10
2-6-1.مننژيت10
2-6-2.عفونت خون10
2-6-3.عفونت هاي دستگاه ادراري10
2-6-4. پنوموني بيمارستاني10
2-7. عفونت هاي بيمارستاني11
2-8. استراتژي هاي درماني عفونت هاي اسينتوباکتر بوماني12
2-9. داروهاي ضد ميکروبي رايج12
2-9-1. پلي ميکسين ها13
2-9-2.آمينوگليکوزيدها13
2-9-3.سولباکتام14
2-9-4. کينولون ها14
2-9-5.تتراسايکلين ها و تايگليسين ها15
2-9-6.آنتي بيوتيک هاي بتالاکتام15
2-9-6-1.پني سيلين ها15
2-9-6-2.کارباپنم ها17
2-9-6-3.سفالوسپورين ها17
2-9-6-4. مونوباکتام ها18
2-9-7.ديگر درمان هاي ترکيبي18
2-10.مکانيسم عمل آنتي بيوتيک هاي بتالاکتام18
2-10-1.پني سيلين ها18
2-10-2.کارباپنم ها19
2-10-3.سفالوسپورين ها19
2-11.مکانيسم هاي مقاومت20
2-11-1.مکانيسم هاي مقاومت آنتي بيوتيکي20
2-11-2.مکانيسم هاي مقاومت به بتالاکتام ها21
2-11-2-1. مکانيسم هاي آنزيمي21
2-11-2-2.مکانيسم هاي غير آنزيمي21
2-12.طبقه بندي بتالاکتامازها22
2-13.بتالاکتامازهاي باکتري هاي گرم منفي24
2-14.بتالاکتامازهاي باکتري هاي گرم مثبت24
2-15.بتالاکتامازهاي وسيع الطيف24
2-16.خصوصيات آنتي بيوتيک هاي وسيع الطيف25
2-17.حساسيت ESBL ها در مقابل آنتي بيوتيک ها25
2-18.انواعESBL ها26
2-18-1.بتالاکتامازهاي تيپ SHV26
2-18-2.بتالاکتامازهاي تيپ TEM26
2-18-3.بتالاکتامازهاي تيپ OXA27
2–18-4.بتالاکتامازهاي تيپCTX-M27
2-18-5. بتالاکتامازهاي تيپ NDM(متالوبتالاکتاماز)27
2-18-6.بتالاکتامازهاي تيپ VIM(متالوبتالاکتاماز)28
2-19. فاکتور هايي که بر بيان بتالاکتامازها اثر مي گذارند28
2-20.درمان عفونت هاي ايجاد شده توسط سويه هاي مولد ESBL29
2-21.کنترل30
2-22.مثال هايي از مکانيسم هاي مقاومت به بتالاکتام ها30
2-22-1.مکانيسم مقاومت به کارباپنم ها30
2-22-2.مکانيسم مقاومت به پني سيلين ها31
2-22-3.مکانيسم مقاومت به مونوباکتام ها32
2-22-4.مقاومت به آمينوگليکوزيدها32
2-22-5. مقاومت به پلي ميکسين ها33
2-22-6.مقاومت به کينولون ها33
2-22-7.مقاومت به تتراسايکلين ها و تايگلسين ها33
2-23.مهارکنندگان بتالاکتامازها34
2-23-1.مکانيسم عمل مهارکنندگان بتالاکتامازها34
2-24.روش هاي شناسايي آنزيم هاي ESBL35
2-24-1-1.آزمايش مجاورت دو ديسک35
2-24-1-2.ترکيب دو ديسک36
2-24-1-3.آزمايش سه بعدي36
2-25.شيوع بيمارستاني و ارزيابي ميزان کنترل36
2-26.اپيدميولوژي جهاني اسينتوباکتر بوماني37
2-27. روش مولکولي دخيل در بررسي باکتري هاي مولد آنزيم هاي بتالاکتاماز وسيع الطيف38
2-27-1. واکنش زنجيره اي پلي مراز (PCR)39
2-28.سوابق و پيشينه تحقيق41
فصل سوم – مواد و روش‏ها
3-1-وسايل موردنياز37
3-2-مواد موردنياز38
3-3-طريقه ساخت محيط هاي کشت40
3-3-1.طرز تهيه محيط بلاد آگار(محيط پايه شرکت Merck )40
3-3-2. طرز تهيه محيط نوترينت آگار (شرکت Merck)40
3-3-3. طرز تهيه محيط SIM(شرکت Merck )41
3-3-4. طرز تهيه محيط مک کانکي آگار(شرکت Merck )41
3-3-5. طرز تهيه محيط اوره براث(شرکت Merck )42
3-3-6. طرز تهيه محيط مولر هينتون آگار(شرکت Merck ):………………..42
3-3-7. طرز تهيه محيط MRVP(شرکت Merck )……………….52
3-3-8. طرز تهيه محيط BHI براث(شرکت Merck)52
3-3-9. طرز تهيه محيط TSI(شرکت Merck ):53
3-3-10. طرز تهيه محيط سيمون سيترات (شرکت Merck )54
3-3-11. طرز تهيه محيط OF(شرکت Merck ):………………………………………………………………………………54
3-4. روش انجام اين پژوهش55
3-4-1.جمع آوري نمونه55
3-4-2.جداسازي باکتري ها55
3-4-3. نگه داري باکتري ها در 80- درجه سلسيوس57
3-5.آنتي بيوگرام57
3-5-1-تهيه سوسپانسيون باکتريايي………………………..57
3-5-2-روش آنتي بيوگرام58
3-6.استخراج ژنوم به روش جوشاندن59
3-7. اندازه گيري غلظت DNA ژنوميک تخليص شده59
3-8. الکتروفورز محصول استخراج ژنوم59
3-9.مواد و وسايل مورد نياز براي اجراي PCR59
3-9-1.DNA الگو59
3-9-2.Master Mix60
3-9-3.پرايمر60
3-9-4.محلول کار پرايمر PCR61
3-10.روش اجرا PCR61
3-11.مواد و وسايل مورد نياز براي اجراي الکتروفورز63
3-11-1.بافرTBE 5X63
3-11-2.بافر TBE 1X63
3-11-3.ژل آگارز 5/1 درصد63
3-12.روش انجام الکتروفورز64
3-13.تعيين توالي64
فصل چهارم – نتايج و بحث
4-1.جداسازي، کشت، تشخيص نمونه هاي باکتري65
4-1-1. درصدو تعداد گونه هاي مختلف موجود در نمونه هاي جدا شده از بيماران65
4-1-2. نتايج تست هاي افتراقي براي گونه هاي اسينتوباکتر بوماني67
4-1-3. تعيين حساسيت آنتي بيوتيکي به روش ديسک ديفيوژن67
4-1-3-1.نتايج حاصل از روش ديسک ديفيوژن براي تمام ايزوله هاي اسينتوباکتر بوماني67
4-1-3-2. تهيه الگوي مقاومت آنتي بيوتيکي69
4-2.استخراج DNA72
4-3.نتايج بدست آمده در بررسي ژن کد کننده آنزيمblaVIM73
4-4.نتايج بدست آمده در بررسي ژن کدکننده آنزيم blaNDM74
4-5:.بحث76
فصل پنجم – نتيجه‏گيري
5-1- نتيجه‏گيري80
5-2-پيشنهادات82
منابع83
چکيده انگليسي94
فهرست جدول‏ها
عنوان صفحه
جدول2-1:طبقه بندي بتالاکتامازها در باکتري هاي گرم منفي23
جدول شماره 3-1: ترکيبات پايه ي محيط بلاد آگار49
جدول شماره 3-2: ترکيبات محيط نوترينت آگار49
جدول شماره 3-3: ترکيبات محيط SIM50
جدول شماره 3-4: ترکيبات محيط مک کانکي آگار50
جدول شماره 3-5: ترکيبات محيط اوره براث51
جدول شماره 3-6: ترکيبات محيط مولر هينتون آگار51
جدول شماره 3-7: ترکيبات محيط MRVP52
جدول شماره 3-8: ترکيبات محيط BHI براث52
جدول جدول شماره 3-9: ترکيبات محيط TSI53
جدول جدول شماره 3-10: ترکيبات محيط سيمون سيترات54
جدول شماره 3-11: ترکيبات محيط OF55
جدول شماره 3-12:خلاصه نتايج حاصل از محيطOF56
جدول شماره3-13:توالي پرايمرهاي مورد استفاده در اين مطالعه60
جدول شماره 3-14: محلول کاري پرايمر61
جدول شماره3-15: ترکيب واکنش PCR براي هر نمونه62
جدول شماره3-16: برنامه انجام واکنش PCR براي ژن VIM62
جدول شماره 3-17 برنامه انجام واکنش PCR براي ژن NDM62
جدول شماره3-18: طرز تهيه بافر TBE 5X63
جدول شماره 4-1 : فراواني اسينتوباکتر بوماني در نمونه کلينيکي مورد بررسي66
جدول شماره 4-2: خصوصيات بيو شيميايي اسينتوباکتر بوماني67
جدول شماره 4-3: نتايج حساسيت اسينتوباکتر بوماني به ديسک هاي آنتي بيوتيکي در نمونه هاي کلينيکي مورد بررسي68
جدول شماره 4-4 : الگوي مقاومت آنتي بيوتيکي در اسينتوباکتر بوماني70
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار شماره 4-1: فراواني سويه هاي اسينتوباکتر در نمونه هاي کلينيکي مورد بررسي66
نمودار شماره 4-2 : درصد مقاومت مشاهده شده در بين ايزوله هاي جدا شده از بيماران69
نمودار شماره4-3: درصد فراواني ژن هاي VIM,NDMمورد مطالعه در اسينتوباکتر بوماني هاي ايزوله شده از بيماران75
فهرست شکل‏ها
عنوان صفحه
شکل 4-1: بررسي کيفي .الکتروفورز نمونه‌هاي DNA استخراج شده با روش جوشاندن بر روي ژل آگارز 172
شکل 4-2: بررسي کمي. نتايج اندازه گيري غلظت DNA استخراجي با روش جوشاندن با دستگاه نانودراپ در طول موج 260 نانومتر72
شکل شماره 4-3: الکتروفورز ژل آگارز محصول آمپلي فايل شده ي ژن blaVIM در سويه هاي اسينتوباکتر بوماني با PCR73
شکل شماره 4-4 :الکتروفورز ژل آگارز محصول آمپلي فاي شده ي ژن blaNDM در سويه هاي اسينتوباکتر بوماني با PCR
چکيده:
مقدمه : در حال حاضر بتالاکتام ها به عنوان داروي انتخابي در درمان عفونت هاي اسينتوباکتر بوماني مقاوم به چند دارو استفاده مي گردد هرچند مقاومت به اين عوامل رو به افزايش مي باشد. اين باکتري با مکانيسم هاي مختلف از جمله توليد بتالاکتامازها به اين داروها مقاومت نشان مي دهند. متالوبتالاکتاماز داراي تيپ هاي مختلفي مي باشند که که در بين آنها blaVIM و blaNDMاز همه بارزتر است .با توجه به اينکه در شهر تهران ميزان فراواني ژن فوق در اسينتوباکتر بوماني مشخص نمي باشد اين مطالعه با هدف بررسي مقاومت دارويي و فراواني ژنهاي هايblaVIM و blaNDM در اسينتوباکتر بوماني هاي ايزوله شده از بيماران شهر تهران به روش مولکولي اجرا گرديد.
روش کار: اين مطالعه برروي 500 نمونه باليني جمع آوري شده از 3 بيمارستان شهر تهران طي مدت دو سال انجام گرديد. پس از جمع آوري نمونه ها با استفاده از روش هاي کشت و بيوشيميايي گونه اسينتوباکتر بوماني شناسائي گرديد. سپس تست حساسيت آنتي بيوتيکي بر روي اين ايزوله ها با روش ديسک ديفيوژن بر اساس دستور CLSI انجام گرديد. در نهايت براي بررسي فراواني ژن هاي blaVIM و blaNDM با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي PCR انجام شد.
نتايج: با توجه به نتايج غربالگري اوليه، بيشترين مقاومت آنتي بيوتيکي در 100 ايزوله اسينتوباکتر بوماني مربوط به آنتي بيوتيک هاي سفي پيم و کمترين مقاومت مربوط به پلي ميکسين B بدست آمد. نتايج PCR نشان داد که به ترتيب 17% و 20%، سويه ها حامل ژن هاي blaVIM و blaNDMمي باشند.
بحث: اين مطالعه نشان داد که ژنهاي کدکننده blaVIM و blaNDMدر حال گسترش در بين سويه هاي باليني اسينتوباکتر بوماني بوده، لذا شناسايي ژنهاي فوق با استفاده از روش مولکوليPCR که روشي سريع و مقرون به صرفه است براي جلوگيري از انتشار عفونت در بيمارستان هاي شهر تهران پيشنهاد مي شود.
کلمات کليدي: اسينتوباکتر بوماني، بتالاکتامازهاي وسيع الطيف، ديسک ترکيبي، VIM، NDM، PCR
فصل اول
مقدمه
1-1-بيان مسئله
اسينتوباکتربوماني از پاتوژن هاي فرصت طلب در حال گسترش بوده، اين باکتري يک باسيل گرم منفي، غير متحرک، غير تخميري، پلي مورف، هوازي اجباري و معمولا کپسول دار است که بر روي محيط هاي معمولي آزمايشگاهي به آساني رشد مي کند . اندازه کلني بين 1 تا 2 ميلي متر، بدون پيگمان و صاف تا موکوئيدي است. در مرحله رشد لگاريتمي شکل باسيل دارند، ولي در مرحله سکون به صورت کوکوباسيل ديده مي شوند اسينتوباکتر بوماني اکسيداز منفي هستند، توانايي احياي نيترات را ندارند، همچنين اندول منفي و کاتالاز مثبت مي باشند. بر روي محيط آگار خون دار معمولا هموليز ايجاد مي کنند و در دماي 44 درجه سلسيوس رشد مي کنند.
اين باکتري ها در روي سطوح خشک تا مدت ها زنده باقي مي مانند. مقاومت بالاي اين باکتري نسبت به شرايط محيطي (11روز در رطوبت نسبي 31 درصد، 4 روز در رطوبت نسبي 10 درصد) امکان حضور اين باکتري را در محيط هاي بيمارستاني افزايش داده است. اين ارگانيسم به عنوان فلور نرمال در پوست و دستگاه تنفسي افراد سالم وجود داشته و در سال هاي اخير به عنوان يک عامل مهم در عفونت هاي بيمارستاني گزارش شده است. با وجود اينکه اين باکتري معمولا از ويرولانس پائيني برخوردار است، اما مي تواند طيف وسيعي از عفونت ها نظير باکتريمي، سپتي سمي و پنوموني همچنين عفونت خون در بيماران دچار سوختگي با ضعف سيستم ايمني را ايجاد نمايد. اسينتوباکتر بوماني بيشترين عامل ايجاد کننده عفونتهاي بيمارستاني به ويژه در بخش مراقبت هاي ويژه مي باشند که نسبت به طيف وسيعي از آنتي بيوتيک ها مقاومت نشان مي دهند. اگرچه سويه هاي اسينتوباکتر بوماني معمولا در آب و خاک يافت مي شوند، ولي منشا سويه هاي اپيدميک مقاومت به چند دارويي آن از بيمارستان مي باشد و اين سويه ها از لحاظ ژنتيکي بسيار شبيه هم هستند. ريسک فاکتورهاي مهم آن مصرف طولاني مدت آنتي بيوتيک، اقامت طولاني در بخش مراقبت هاي ويژه (ICU) و بيماري هاي جدي مي باشد.
اسينتوباکتر بوماني به عوامل ضد ميکروبي بسيار مقاوم است که اين مقاومت مي تواند ذاتي و يا از طريق بدست آوردن عوامل ژنتيکي مقاومت باشد. درمان عفونت هاي اسينتوباکتر اغلب در مواردي که فنوتيپ مقاومت، چند دارويي است مشکل مي باشد. اين مقاومت ها اغلب با واسطه ژن هائي صورت مي گيرد که بر روي عناصر ژنتيکي متحرک مثل ترانسپوزون ها و اينتگرون ها قرار داشته و به سادگي در ميان باکتري ها انتشار مي يابند. در حال حاضر بتالاکتام ها به عنوان داروي انتخابي در درمان عفونت هاي اسينتوباکتر بوماني مقاوم به چند دارو استفاده مي گردد، هرچند مقاومت به اين عوامل رو به افزايش مي باشد.
اين باکتري با مکانيسم هاي مختلف به اين داروها مقاومت نشان مي دهند که مي توان به موارد زيراشاره کرد. يکي از اين عوامل ايجاد کننده مقاومت توليد متالوبتالاکتاماز مي باشد. متالوبتالاکتامازها قادر به هيدروليز طيف وسيعي از بتالاکتام ها از جمله پني سيلين ها، سفالوسپورين ها و کارباپنم ها هستند، اما توانايي هيدروليز مونوباکتام ها (آزترونام) را ندارند. متالوبتالاکتاماز بر اساس ساختار مولکولي به شش نوع تقسيم مي شود که شامل ژنهاي:AIM,NDM ,SPM ,SIM ,GIM ,IMP ,VIM هستند که در بين آنها VIM و NDM از همه بارزتر مي باشد .
1-2.ضرورت اجراي تحقيق:
شيوع وگسترش عفونت هاي بيمارستاني ازعلل شايع و مهم مرگ و مير، ناتواني، افزايش طول مدت بستري، تحميل وافزايش هزينه هاي بيمارستاني و بروزمشکلات بهداشتي مي باشند. اسينتوباكترهاي مقاوم به چنددارو مشكلات درماني دردنيا ايجاد نموده اند و دركشورايران نيزيك مشكل نوظهور مي باشند.
در تحقيقات به عمل آمده به ويژه درايران ، به حضور blaVIM و blaNDM که منجر به نتايج منفي کاذب مي گردند، کمتر اشاره شده است بنابراين ضروري است که براي شناسايي دقيق اين نوع مقاومت از روش هاي مولکولي در کنار روش هاي فنوتيپي استفاده کنيم
1-3.اهداف پژوهش:
تعيين ميزان مقاومت داروئي و ميزان شيوع ژنهاي blaVIM و blaNDM در سويه هاي اسينتوباکتر بوماني ايزوله شده از بيماران شهر تهران در سال 1392 با روش مولکولي PCR.
اهداف فرعي:
تعيين الگوي مقاومت دارويي در ايزوله هاي جدا شده اسينتوباکتر بوماني با روش ديسک ديفيوژن
شناسايي ژن مقاومتblaVIM در سويه هاي اسينتوباکتر بوماني با روش PCR
شناسايي ژن مقاومتblaNDM در سويه هاي اسينتوباکتر بوماني با روش PCR
1-4.سوالات فرضيه:
آيا ژن هاي کدکننده بتالاکتامازها در اسينتوباکتر بوماني وجود دارند و از طرفي اگر ژن هاي کد کننده بتالاکتامازها در اسينتوباکتر بوماني وجود دارند ميزان شيوع آن ها چقدر است؟
1-5.تعريف متغيرها:
اسينتوباکتر بوماني:
اين باکتري پاتوژن فرصت طلب، کوکوباسيل، گرم منفي، هوازي اجباري، غير تخمير کننده، غير متحرک، اکسيداز منفي، کاتالاز مثبت مي باشد. بر پايه طبقه بندي جديد در خانواده Moraxelaceae در راسته Gammaproteobacteria قرار مي گيرد. اسينتوباکتر بوماني که به بيش تر آنتي بيوتيک ها مقاوم مي باشد سبب ايجاد عفونت ادراري، مننژيت، پنوموني و عامل اصلي عفونت بيمارستاني مخصوصا در بيماران بستري در بخش مراقبت هاي ويژه مي باشد.
بتالاکتامازهاي وسيع الطيف:
بتالاکتام ها دسته اي از آنتي بيوتيک ها(پني سيلين، سفالوسپورين، مونوباکتام و کارباپنم) هستند که از سنتز ديواره سلولي با اتصال آنزيم هاي دخالت کننده در توليد پپتيدوگليکان يعني، پروتئين هاي متصل شونده به پني سيلين جلوگيري کرده و تحت تاثير آنزيم هاي بتالاکتاماز، حلقه ي آسيل آن ها هيدروليز مي شود.
PCR:
از مهمترين و تاثير گذارترين تکنيک هاي ابداع شده در زيست شناسي و پزشکي مي باشد، اين روش در واقع تکثيرDNA به شکل مصنوعي مي باشد. استفاده از PCR براي تشخيص سويه هاي حامل ژن هاي کدکننده آنزيم هاي بتالاکتامازي، مزاياي بسياري دارد که شامل حساسيت زياد آن در تشخيص الگوهاي هدف، سرعت بالا و نتايج قابل اعتماد آن به دليل اختصاصي بودن فوق العاده آن مي باشد.
NDM:
blaNDM يک متالوبتالاکتاماز کلاس B آمبلر و 3 بوش ميباشد. در سال 2009 در دهلي نو گزارش شده است و از آن زمان به بعد به طور گسترده اي در انگلستان و آسياي جنوب شرقي منتشر شده است. در حال حاضر ژن blaNDMدر طيف وسيعي از باکتري هاي گرم منفي در محيط زيست دهلي نو از جمله در پاتوژن هاي جدي شيگلا و ويبريوکلرا به طور گسترده اي شناسايي شده است.آنزيم blaNDMباعث مي گردد باکتري به آنتي بيوتيک هاي بتالاکتام به استثناء آزترونام مقاومت نشان مي دهد.
VIM:
blaVIMيک متالوبتالاکتاماز کلاس B آمبلر و 3 بوش مي باشد. اولين سويه ي حاوي ژن blaVIM نيز در ايتاليا در سال 1997 مشاهده شد. باکتري هاي داراي ژن blaVIM قادر به هيدروليز طيف وسيعي از بتالاکتام ها از جمله پني سيلين ها، سفالوسپورين ها و کارباپنم ها هستند، اما توانايي هيدروليز مونوباکتام(آزترونام)را ندارند.

فصل دوم
مروري برتحقيقات انجام شده
2-1.تاريخچه جنس اسينتوباکتر بوماني:
اوايل قرن 20 در سال 1911 ميلادي ميکروبيولوژيست آلماني بنام بيجرينگ 1 ارگانيسمي بنام Calcoaceticus micrococcus را از خاک جدا کرد(.طي دهه هاي بعد ارگانيسم هاي مشابهي توصيف شدند که شامل 15 گونه و جنس متفاوت بودند که مي توان از آنها نام برد( پلگ2 و همکاران،2008) :
Herellea vaginicol ،Niesseria winogradskyi ،Acromobacter anitratus,
Bacterium anitratum ،Alcaligenes heamolysans ،Diplococcus mucosus,
Micrococcus calcoaceticus، Mima polymorpHa ،Achromobacter mucosus,
Akinetos نام يوناني جنس رايج اسينتوباکتر مي باشد که به معني غير متحرک مي باشد که درسال 1954 توسط بريشو3و پريوت 4 براي جدا کردن ميکروارگانيسم هاي غير متحرک از متحرک هاي جنس آکروموباکتر به کار گرفته شد.
2-2.تاکسونومي رايج اسينتوباکتر بوماني:
اسينتوباکتر(5A) کوکوباسيل گرم منفي است که اخيرا در خانواده جديد Moraxelaceae و راسته Gammaproteobacteria قرار مي گيرند(روساو و همکاران6، 1991).
در سال 1986 مطالعاتي بر پايه هيبريداسيون DNA-DNA انجام شد که از 12 گروه DNA 2سويه اصلي A. baumannii, A. calcoaceticus تشخيص داده شد(بويووت و گريمونت7 1986).
همچنين به تدريج از گياهاني که در فاضلاب بودند و به صورت لجن درآمده بودند 7 گونه جدا شد که به آن اشاره شده( کار و همکاران 8، 2007) :
A. Tandoii, A. grimonti, A. galcoaceticus, A. gerneri, A.bouvetti,
A. baylyi, A. Towneri, A.tjerbergiae, A. baumanni ,
2-3.شناسايي گونه هاي اسينتوباکتر:
اسينتوباکترها بصورت کوکوباسيل و گرم منفي بوده ولي رنگ آميزي بسيار سختي دارند به همين دليل گاهي اشتباها اين باکتري بصورت کوکسي گرم منفي و يا گرم مثبت ديده مي شود. براي نگهداري اسينتوباکتر با منشا انساني مي توان از محيط کشت بلاد آگار تهيه شده با خون گوسفندي استفاده کرد. بيشتر گونه هاي اسينتوباکتر کلني هاي مات و کوچکي دارند به جزء کلني هاي A.baumanni , A. calcoaceticus که مشابه کلني انتروباکترياسه 3-5/1ميلي متر قطر دارند.سويه اسينتوباکتر هموليتيکوس و چندين سويه ي ديگر که در حال حاضر به خوبي مشخص شده اند نظير اسينتوباکتر بيوتيپ 13, BJ14, BJ15 16و17ممکن است بر روي محيط بلاد آگار تهيه شده توسط خون گوسفندي توليد هموليز کنند که اين خصوصيت به هيچ عنوان در اسينتوباکترهايي که متعلق به کمپلکس A.baumanni ،A.calcoaceticus هستند مشاهده نشد.
متاسفانه هيچ تست متابوليکي که تنها براي تشخيص اسينتوباکتر از ديگر باکتري هاي گرم منفي غير تخميري به کار گرفته شود وجود ندارد. استفاده از محيط کشت غني شده با pH پايين که به شدت هوادهي شده و سرشار از ذخاير معدني همراه با استات و يا ديگر منابع مناسب کربن و نيترات به عنوان منبع نيتروژن مي تواند روش مناسبي براي شناسايي بدون ابهام اسينتوباکتر از نمونه هاي محيطي و کلينيکي باشد.
استفاده از محيط کشت اسينتوباکتر جزء آسان ترين روش هاي شناسايي اسينتوباکتر از يک جمعيت باکتريايي مخلوط مي باشد، ولي هيبريداسيون DNA-DNA به عنوان يک روش استاندارد بکار گرفته مي شود(پلگ و همکاران، 2008).
2-4.جايگاه طبيعي اسينتوباکتر بوماني:
اسينتوباکتر بوماني جزء باکتري هايي هستند که از تمام نمونه هاي جمع آوري شده از خاک و سطح آب قابل جداسازي مي باشند در نتيجه مي توان گفت در همه جا حضور دارند. بيشتر گونه هاي اسينتوباکتر که از نمونه هاي کلينيکي انساني جدا شده اند حداقل يک سري از ويژگي ها را به عنوان پاتوژن هاي انساني دارا هستند.در بررسي هاي اپيدميولوژي که بر روي پوست و اعضاي موکوئيدي انسان انجام شد 43% از افرادي که در بيمارستان بستري نبودند، حامل اين باکتري بر روي پوست خود بودند که نشان مي دهد اين باکتري جزئي از فلور نرمال پوست انسان مي باشد که بيش ترين گونه هاي يافت شده، اسينتوباکترلوفي، اسينتوباکتر جانسوني، اسينتوباکتر جوني و اسينتوباکتر بيوتيپ 3 بود (پلگ و همکاران ،2008). و اين در صد در افرادي که در بيمارستان ها بستري شده اند به 75% و حتي بالاتر هم رسيده است ( برلو و همکاران 9، 1999 ).
برلو سبزيجات انگلستان را مورد آزمايش قرار داد و دريافت که از 177 نمونه سبزيجات آزمايش شده، کشت 30 نمونه (17%) از نظر وجود اسينتوباکتر مثبت بوده، همچنين اسينتوباکتر بوماني و اسينتوباکتر بيوتيپ11 در اين ميان شايع ترين گونه ها بودند( برلو و همکاران ،1999). ميزان انتقال اسينتوباکتر بصورت مدفوعي مورد مطالعه قرار گرفت و نشان داده شد که 25% افراد سالم بصورت ناقل هستند که از همه مهمتر اسينتوباکتر جانسوني و اسينتوباکتر بيوتيپ 11 مي باشد (پلگ و همکاران ،2008 ).

2-5.فاکتورهاي بيماري زايي اسينتوباکتر:
در مورد فاکتورهاي بيماريزايي اسينتوباکتر اطلاعات کمي در دسترس بوده است، ولي اخيرا اطلاعاتي نظير بدست آوردن تعيين توالي ژنوم اسينتوباکتر به ما کمک مي کند تا جزاير پاتوژنيستي و آرايش مقاومت دارويي اسينتوباکتر بوماني را مشخص کنيم.
در ارتباط با تعدادي از ژن هاي مشخص شده که مقاومت آنتي بيوتيکي، مقاومت فلزات سنگين و آنتي سپتيک را کد مي کردند پاتوژن هاي ديگري نظير سودوموناس، سالمونلا و اشريشياکلي وجود دارند که نشان دهنده ي اين است که انتقال ژنتيکي عوامل ويرولانس نيز امکان پذير مي باشد.
پس از انجام دادن چندين موتاسيون تصادفي در سويه ي ATCC اسينتوباکتر بوماني Smit توانست چندين موتانت را در جزيره پاتوژنيسيته متفاوت، با ويرولانس خفيف توسط مدل هاي Gaenohabtidis elegans و Dictyostelium که مدل هاي غير پستانداران بودند مشخص کند.
ژن موتاسيون يافته مربوط به فاکتورهاي رونويسي، سيستم هاي انتقال چند دارو به خارج و اوره آز بودند. متاسفانه ويرولانس اين موتانت ها در مدل هاي پستانداران بررسي و پياده نشد. وقتي ژنوم اسينتوباکتر بوماني با ژنوم A.baylyi که بيماري زا مي باشد مقايسه شد مشخص گرديد که 28 دسته ي ژني در آن وجود دارد که تنها مختص به اسينتوباکتر بوماني مي باشد که 16 تا از اين ژن ها توانايي ايجاد تهاجم و بيماري زايي را داشتند.
يکي از جالب ترين آنها يک جزيره ي 133740 جفت بازي بود که نه تنها حاوي ترانسپوزون ها و اينتگرازها بود بلکه واجد ژن هايي بود که مشابه سيستم ويرولانسي، ترشحي تيپ IV در Legionella/Coxiella بود.(توماراس و همکاران10،2003)
ديگر ژن ها شامل آن هايي بود که در تشکيل پوشش سلولي، بيوژنز پيلوس، جذب و متابوليسم آهن نقش داشتند. مطالعات بيشتري که بر روي مکانيسم هاي اختصاصي بيماري زايي در اسينتوباکتر بوماني صورت گرفت بر روي سيستم اکتساب آهن بر پايه ي سيدروفورها و شکل گيري بيوفيلم ها و پيوستگي و عملکرد OMP و LPS اسينتوباکتر بوماني متمرکز بود. توانايي اسينتوباکتر بوماني براي چسبيدن به سطوح و تشکيل بيوفيلم ها بر روي اجسام بي جان علت پايداري اين ارگانيسم ها در محيط بيمارستان بود.توماراس نشان داد که شکل گيري بيوفيلم در اسينتوباکتر بوماني به طور فنوتيپي همراه با شکل گيري پيلوس و توليد اگزوپلي ساکاريد بود.
آناليز بيشتر توالي ها مشخص کرد، اپرون پلي سيسترونيک Csu شامل 5ژن است که شبيه ژن هايي مي باشد که پروتئين هاي مربوط به چاپرون و همچنين پروتئين هايي را که در تجمع پيلوس در ديگر باکتري هاي گرم منفي نقش دارد را کد مي کند. چسبندگي اسينتوباکتر بوماني به سلول هاي اپيتليال برونش انسان و گلبول هاي قرمز به علت وجود ساختاري شبه پيلوس بوده که در ايجاد اين چسبندگي نقش دارد.
اسينتوباکتر بوماني پس از اتصال به سلول هاي انسان، مي تواند باعث تحريک خودکشي سلول توسط OMP شود.اين پروتئين در ميتوکندري تجمع پيدا کرده و منجر به خودکشي سلول از دو مسير وابسته به کاسپاز و مسير مستقل مي شود.
2-6.منشا کلينيکي عفونت هاي اسينتوباکتر بوماني:
2-6-1.مننژيت:
مننژيت جزء بيماريي هايي محسوب مي شود که بيشتر توسط پاتوژن هاي گرم منفي اتفاق مي افتد که اسينتوباکتر بوماني جزء اين پاتوژن ها مي باشد و باعث 70% مرگ و مير مي شود (متان و همکاران11 ، 2007 )

2-6-2.عفونت خون:
در طي سال هاي 1995 تا 2002 مطالعاتي که بر روي عفونت هاي بيمارستاني در آمريکا انجام شد نشان داد اسينتوباکتر بوماني مسئول 3/1% تمام عفونت هاي تک ميکروبي بيمارستاني در محيط خون بوده که جزء دهمين عامل رايج امراض محسوب مي شود.
اسينتوباکتر بوماني باعث ايجاد 6/1% عفونت هاي خوني در بخش مراقبت هاي ويژه12) ( ICU است ولي در محيط خارج از ICU 9/0% باعث ايجاد عفونت هاي خوني مي شود. ميزان مرگ ومير ايجاد شده توسط اسينتوباکتر بوماني در محيط خون 34 تا 4/43% در ICU و3/16% در محيط خارج از ICU بود.
اسينتوباکتر بوماني تقريبا 26 روز پس از بستري شدن عفونت هاي خوني ايجاد مي کند و سودوموناس آئروژينوزا و کانديدا رتبه ي بالاي مرگ و مير را در محيط ICU دارا مي باشند (ويسپيلينگوف و همکاران13- ،2003)
2-6-3.عفونت هاي دستگاه ادراري:
اسينتوباکتر بوماني يکي از عوامل فرعي ايجاد کننده ي عفونت هاي دستگاه ادراري، که مسئول 6/1% عفونت هاي مجاري ادراري در ICU مي باشد، به طور معمول اين ارگانيسم همراه با عفونت هاي ايجاد شده در زمان استفاده از کاتتر مرتبط مي باشد ( باستي و همکاران14 ، 2008 ).
2-6-4. پنوموني بيمارستاني:
در مطالعات انجام شده بر روي بيماران بستري در ICU مشخص شده که 5 تا 10% اين افراد در اثر وجود باکتري اسينتوباکتر بوماني به پنوموني مبتلا شده اند و شکي نيست که پنوموني وابسته به ونتيلاتور(15VAP) در اثر اسينتوباکتر بوماني رخ مي دهد(گاينس و ادوارد16 ، 2005 ).
2-7. عفونت هاي بيمارستاني:
عفونت هاي بيمارستاني به بروز يک بيماري جديد در فرد اطلاق مي شود که در اثر بستري فرد در بيمارستان رخ مي دهد که در بخش مراقبت هاي ويژه ICU بيشتر از ساير بخش ها مشکل ايجاد مي کند ( يربن و همکاران 17، 2003 ).
مهم ترين راه انتقال عفونت از طريق دست هاي شسته نشده حاملين يعني پرسنل بيمارستان مي باشد. نقش عفونت هاي بيمارستاني در افزايش مورتاليتي، موربيديتي و افزايش هزينه هاي بيمارستاني به خوبي روشن شده است و همچنين عفونت هاي بيمارستاني بعد از بيماري هاي قلبي عروقي، سرطان ها و عفونت ناشي از اجتماعات، چهارمين عامل معمول در مرگ و مير مي باشد بنابراين درمان مناسب عفونت ها از اهميت حياتي برخوردار است. درمان مناسب شامل استفاده از دارو در يک دوره زماني مناسب، شروع درمان ضد ميکروبي در مراحل اوليه عفونت و استفاده از عوامل ضد ميکروبي صحيح مي باشد( نجاري و همکاران18،2003).
يکي از مهم ترين مشکلات در مورد عفونت هاي بيمارستاني ،انتشار قطعي مقاومت دارويي مي باشد. مقاومت نسبت به عوامل ضد ميکروبي در بين انواع زيادي از پاتوژن ها به خصوص پاتوژن هاي دخيل در عفونت هاي بيمارستاني، انتشار گسترده يافته است که به مشکل شدن درمان عفونت ها منجر مي گردد و اين امر سبب افزوده شدن ميزان مرگ و مير در بيماران مي شود به طوري که يک سوم از بيماران بزرگسال بد حال بستري در ICU به دليل بيماري زمينه اي و کاهش ايمني بدن آن ها بر اثر بيماري همراه عفونت، فوت مي شوند.
يک راه طبقه بندي عفونت ها در ICU بر اساس معيار زمان مي باشد و بروز عفونت پس از 48 ساعت از پذيرش در ICU ، عفونت بيمارستاني در نظر گرفته مي شود. راه ديگر طبقه بندي بر اساس حالت حاملين مي باشد که در اين طبقه بندي، عفونت اندوژن اوليه هم توسط بيمار حمل شده است و عفونت اندوژن ثانويه توسط ميکروارگانيسم هايي بروز مي نمايد که بعد از پذيرش در ICU کسب شده باشند که معمولا اين ارگانيسمها به گروه باکتري هاي غير معمول مثل باسيل هاي گرم منفي هوازي و استافيلوکوکوس اورئوس مقاوم به متي سيلين تعلق دارند.
باکتري هاي کومنسال مانند اشريشياکلي و استافيلوکوک ها عمدتا باعث ايجاد عفونت هاي بيمارستاني مي شود.طيف پاتوژنهاي بيمارستاني در دهه گذشته تغيير يافته است به طوري که کوکسي گرم مثبت مثل استافيلوکوک ها و انتروکوک ها به تدريج مغلوب باکتري هاي گرم منفي شده اند و پاتوژن هاي قارچي، بخصوص در جمعيت بيماران ضعيف از نظر ايمني اهميت بيشتري را کسب کرده اند
( ليبراتي و همکاران19، 2004 ).
2-8. استراتژي هاي درماني عفونت هاي اسينتوباکتر بوماني:
قبل از سال 1970،درمان عفونت هاي ايجاد شده توسط اسينتوباکتر به وسيله ي تعدادي ازآنتي بيوتيکها نظير بتالاکتام ها، آمينوگليکوزيدها وتتراسايکلين ها امکان پذير بوده ولي هم اکنون مقاومت به تمام آنتي بيوتيک هاي شناخته شده در اسينتوباکتر بوماني قابل مشاهده است و همين امر بيشتر متخصصان را در يک قلمرو نامشخص قرار داده و درمان هاي سودمند و رايج آنتي بيوتيکي را تحت مخاطره قرار داده است
( فالاگاس و بليزيوتيس20، 2007 ).
2-9. داروهاي ضد ميکروبي رايج:
انتخاب آنتي بيوتيک ها براي درمان تجربي هنوز هم مورد بحث قرار دارد و بايد بر پايه ي آخرين ميزان حساسيت اعلام شده توسط موسسات تجويز گردد. با وجود تنوع ايجاد کننده عوامل مقاومت در اسينتوباکتر بوماني، درمان بايد بر پايه ي انجام تست هاي حساسيت آنتي بيوتيکي مناسب انجام بگيرد. کارباپنم دارويي است که بر ضد طيف وسيعي از سويه هاي اسينتوباکتر بوماني که در سطح جهان گسترده است نيز فعال مي باشد و براي درمان جدي عفونت هاي ايجاد شده توسط اين باکتري مورد استفاده قرار مي گيرد ( فالاگاس و بليزيوتيس20 ، 2007 ).
2-9-1. پلي ميکسين ها:
آنتي بيوتيک هاي پپتيدي نظير پلي ميکسين ها( کلي ستين، پلي ميکسين E و پلي ميکسينB) در نتيجه مقاومت سويه هاي اسينتوباکتر بوماني به تمام داروهاي ضد ميکروبي رايج شدند و در سال 1947 شناسايي و از باسيلوس پلي ميکسا نشات گرفتند. اين آنتي بيوتيک ها باعث جابجايي ليپيدها، آسيب ديدگي غشاء ناپايدار اسمزي مي شوند به اين صورت که مولکول هاي آنيوني ليپوپلي ساکاريد(LPS21) غشاء خارجي باکتري گرم منفي را مورد حمله قرار داده و باعث ايجاد واکنش بين غشاء خارجي و غشاء داخلي سلول شده و منجر به مرگ سلولي مي شوند (کليوسل و همکاران22، 2007 ).
هم اکنون دو شکل تجارتي کلي ستين قابل دسترس است.کلي ستين متانوسولفات که براي مصارف تزريقي و ديگري کلي ستين سولفات که براي مصارف دهاني و موضعي مي باشد . هر دو شکل مي توانند به صورت تنفسي نيز مورد استفاده قرار يگيرند.
کلي ستين که به صورت تنفسي مصرف مي شود به ميزان زيادي باعث کاهش سميت سيستماتيک و تقويت تاثيرگذاري دارو در جايگاه هاي عفونت مي شود.
در تحقيقي که توسط سانگ انجام شد 86% افراد توسط سودوموناس آئروژينوزا و يا اسينتوباکتر بوماني، به پنوموني مبتلا شده بودند که اين سويه ها به تمام آنتي بيوتيک ها به جزء پلي ميکسين مقاوم بودند و کلي ستين تنفسي دريافت مي کردند و پاسخ ميکروبيولوژي مناسبي مشاهده شد .
2-9-2.آمينوگليکوزيدها:
اسينتوباکتر بوماني داراي ژن هايي است که آنزيم هاي تغيير دهنده آمينوگليکوزيدها را در اينتگرون کلاس 1 کد مي کنند و باعث ايجاد مقاومت به چندين دارو مي شود.
طي گزارشي که از ژاپن اعلام شده ، در اسينتوباکتر بوماني سويه (armA) متيلاسيون 16SrRNA ديده شده است که باعث جفت شدن نواحي اتصال آمينوگليکوزيدها با جايگاه هدف خودش مي شود در نتيجه مقاومت بسيار بالايي به تمام آمينوگليکوزيدهايي که از نظر کلينيکي مفيد هستند نظير توبرامايسين، جنتامايسين، آميکاسين ايجاد مي کند . ژن armA توسط پلاسميد انتقال مي يابد و داخل ترانسپوزون قرار گرفته است.پمپ AbeM جزئي از خانواده پمپ هاي MATE مي باشد که آمينوگليکوزيدها، سوبستراهايي براي اين پمپ مي باشند( مگنت و همکاران23 ، 2001 ).
2-9-3.سولباکتام:
سولباکتام ها در حقيقت يکي از سه مهارکننده ي بتالاکتاماز ها مي باشند که اين خاصيت آنها به علت اتصالشان به پروتئين متصل شونده به پني سيلين مي باشد( لوين24، 2002 ). تحقيقاتي که در زمينه ي مقايسه ي فعاليت سولباکتام به تنهايي با حالتي که در ترکيب با بتالاکتام ها مي باشد انجام شده است، به وضوح نشان مي دهد که فعاليت ذاتي سولباکتام ها بيشتر از توانايي آن ها براي مهار کردن بتالاکتامازها مي باشد. حساسيت سويه هاي اسينتوباکتر بوماني به سولباکتام ها در شرايط آزمايشگاهي بسيار متفاوت است و وابسته به ناحيه ي جغرافيايي مي باشد، بنابراين انجام تست هاي حساسيت با استفاده از روش مايع، بيش از روش ديسک ديفيوژن پيشنهاد مي شود.
يوربن طي مطالعاتش در اسپانيا نشان داد که از 10 بيماري که آمپي سيلين-سولباکتام را به مدت بيشتر از 3



قیمت: تومان


پاسخ دهید